噬菌體展示技術(shù)之抗體親和力成熟

近年來(lái)，隨著抗體藥物的廣泛上市，抗體已經(jīng)取代基因治療成為生物制藥領(lǐng)域的主要生力軍。而抗體在疾病診斷、治療和預(yù)防方面的作用很大程度上取決于其親和力的高低，隨著抗體工程技術(shù)的不斷發(fā)展，如何提高抗體親和力已成為抗體工程的難題之一。圍繞這一問(wèn)題人們已經(jīng)從不同的角度展開了研究，例如，提高抗體庫(kù)的質(zhì)量、增加抗體庫(kù)的多樣性、進(jìn)行抗體重鏈或輕鏈的替換以及點(diǎn)突變有目的進(jìn)行氨基酸替換等都能不同程度地提高抗體親和力。

抗體親和力表示抗體與抗原結(jié)合能力的大小。抗體親和力成熟是指機(jī)體正常存在的一種免疫功能狀態(tài)。在體液免疫中，再次應(yīng)答所產(chǎn)生抗體的平均親和力高于初次免疫應(yīng)答，這種現(xiàn)象稱為抗體親和力成熟。

噬菌體展示技術(shù)作為一種*的抗體庫(kù)構(gòu)建技術(shù)能結(jié)合多種技術(shù)手段，于體外實(shí)現(xiàn)抗體的親和成熟，并配合親和篩選方法獲得具有高親和力的抗體。在噬菌體抗體展示技術(shù)中，VH和VL基因的隨機(jī)重組，在一定程度上模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過(guò)程。如果結(jié)合其它技術(shù)則可以使抗體的親和力提高到一個(gè)更高的層次，下面介紹一些抗體親和力成熟的方法。

體外抗體親和力成熟的幾種策略

要想實(shí)現(xiàn)抗體的親和力體外成熟，就必須充分地了解天然抗體的親和力體內(nèi)成熟原理，設(shè)計(jì)模擬體內(nèi)可能出現(xiàn)和存在的變化，從而促進(jìn)抗體的體外進(jìn)化。

天然抗體的親和力成熟可以分為體細(xì)胞高頻突變和克隆選擇兩個(gè)過(guò)程。在天然抗體親和力成熟的過(guò)程中，抗原刺激下的體細(xì)胞高頻突變有著舉足輕重的作用，因此親和力體外成熟的策略也多在抗體基因突變水平上，即采用各種突變方法來(lái)模擬體內(nèi)的高頻突變。

1. 隨機(jī)突變

（1）錯(cuò)配PCR

通過(guò)改變PCR反應(yīng)條件，提高核酸錯(cuò)配率將隨機(jī)突變引入基因序列。該技術(shù)可以通過(guò)提高鎂離子濃度、加入錳離子、失衡4種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）濃度、使用低保真DNA聚合酶等方法，來(lái)提高抗體基因的突變率。

除此之外，突變率的高低也可以采用改變模板DNA 的復(fù)制次數(shù)進(jìn)行控制。復(fù)制次數(shù)越多，突變率將累積得越高。理論上經(jīng)過(guò)多輪的PCR反應(yīng)可獲得0.15%~3%的突變頻率，再用突變的抗體基因庫(kù)建立噬菌體抗體庫(kù)，最后從中篩選高親和力抗體。噬菌體展示技術(shù)有效的改善了使用錯(cuò)配PCR技術(shù)導(dǎo)致的抗體親和性和特異性的喪失，以及有效突變體過(guò)少的問(wèn)題。

（2）DNA改組

DNA改組技術(shù)是對(duì)同源的抗體基因，采用脫氧核糖核酸酶Ⅰ將其切割成不超過(guò)50 bp的片段，再隨機(jī)組合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增成完整的抗體基因。它包含了抗體片段隨機(jī)化切割、重組和篩選的過(guò)程，一定程度上模擬了天然抗體的親和力成熟過(guò)程，并加快了體外定向進(jìn)化速度。采用連續(xù)多輪的DNA改組具有去除有害突變優(yōu)勢(shì)。另外，DNA 改組獲得的突變體，突變位點(diǎn)可以位于非抗原直接接觸的區(qū)域，有擴(kuò)大庫(kù)容的作用。

（3）鏈改組

鏈改組即鏈替換技術(shù)，是固定抗體的一條輕鏈或重鏈不變，而將另一條重鏈或輕鏈經(jīng)過(guò)突變處理后，重新與固定鏈配對(duì)，以提高抗體親和力的方法。 該方法保留一條鏈不變，目的是為了保持抗體的特異性，而將經(jīng)過(guò)突變處理的另一條鏈與其配對(duì)，是為了增加抗體的親和力，以篩選到更高親和力的抗體，重復(fù)進(jìn)行鏈替換和親和力篩選將產(chǎn)生更高親和力的抗體。

將噬菌體展示技術(shù)與此技術(shù)結(jié)合構(gòu)建次級(jí)抗體庫(kù)將使該法更便利。鏈改組技術(shù)能有效提高抗體親和力，但如果無(wú)法明確了解zhiding抗原的基因結(jié)構(gòu)，或者抗體基因片段未能擁有一個(gè)比較完整的初級(jí)抗體庫(kù)，則不適合使用鏈改組技術(shù)。

（4）突變株

Escherichia coli MutD5 是常用的大腸埃希菌突變株，該菌株可以校對(duì)和復(fù)制后錯(cuò)配修復(fù)缺陷，產(chǎn)生高頻率的單個(gè)堿基替換，突變率高于普通菌株105倍。突變株法的優(yōu)勢(shì)是突變發(fā)生在轉(zhuǎn)化宿主菌后，而其他方法的突變均發(fā)生于轉(zhuǎn)化之前，而轉(zhuǎn)化效率是限制大容量突變庫(kù)構(gòu)建的關(guān)鍵因素之一。使用突變株法可以構(gòu)建庫(kù)容為1012 - 1014個(gè)克隆的超大容量抗體庫(kù)，利用噬菌體展示技術(shù)篩選高親和抗體，通過(guò)該法的可以獲得一些未能在定向突變中獲得的突變體。但是該方法較難對(duì)突變率進(jìn)行控制，且獲得的隨機(jī)突變也可能發(fā)生于載體部分，造成有害突變。

2. 定向引入突變

CDR重組

由于天然抗體在親和力成熟過(guò)程中，體細(xì)胞高頻突變發(fā)生區(qū)域并非均勻分布，而是主要集中在與抗原直接接觸的CDR(complementarity-determining region,CDR)區(qū)。這樣既可以獲得足夠的序列多樣性，又不會(huì)破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。因此在抗體的親和力體外成熟中，CDR 區(qū)是最常選用的定點(diǎn)突變區(qū)域。

CDR重組技術(shù)即將多種突變或經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的DNA序列引入抗體多個(gè)CDR區(qū)，再利用抗體庫(kù)技術(shù)將這些CDR區(qū)進(jìn)行多次重組，已達(dá)到親和成熟的目的。該技術(shù)使噬菌體展示技術(shù)得到了更廣泛的應(yīng)用，并且相對(duì)于熱點(diǎn)突變其能更完整的模擬體內(nèi)抗體輕鏈與重鏈重排的整個(gè)過(guò)程，該方法可結(jié)合多種技術(shù)使用。

除了CDR區(qū)突變外，天然抗體親和力成熟中的突變熱點(diǎn)也是常見的定點(diǎn)突變位點(diǎn)。這些熱點(diǎn)通常包含或接近AGY和RGYW（R = A or G；Y = C or T；W = A or T）序列。

基因工程抗體親和力成熟的過(guò)程其實(shí)就是一個(gè)體外的分子進(jìn)化，多樣化的選擇和擴(kuò)增的過(guò)程。根據(jù)對(duì)抗體親和力成熟的認(rèn)知，各種模擬體細(xì)胞高頻突變有效引入突變的策略是親和力成熟的核心，而基于不同原理的突變策略的組合應(yīng)用可能對(duì)基因工程抗體的親和力成熟有協(xié)同增強(qiáng)的作用。研究基因工程抗體的親和力成熟，制備得到高親和力的抗體，可以幫助我們?cè)谂R床上使用低劑量達(dá)到我們需要的生物學(xué)效應(yīng)，減少劑量導(dǎo)致的毒性反應(yīng)，增加治療效果，在抗體藥物研發(fā)進(jìn)程中至關(guān)重要。