重組蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化、復(fù)性和定量

按操作手冊進(jìn)行，具體步驟如下。

一、重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)

1.挑取轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的單菌落，接種于 3ml 選擇性 LB 液體培養(yǎng)基中，37 oC，250rpm/min 振搖培養(yǎng)過夜。

2. 次日將培養(yǎng)過夜的菌液 500 μl 再接種于 10 ml（1:::20）選擇性 LB 液體培養(yǎng)基中，37 oC，250 rpm/min 振搖培養(yǎng)至光密度（OD600=0.6）時(shí)，取 1 ml 樣本作為誘導(dǎo)前標(biāo)本，10000g 離心 1 min 收集菌體沉淀，－20 oC 凍存?zhèn)溆谩?/p>

3. 加入 1 mol/L IPTG 于菌液中，使 IPTG 終濃度為 1 mM，37 oC，250 rpm/min振搖培養(yǎng) 4～5 小時(shí)。取 1 ml 樣本作為誘導(dǎo)后標(biāo)本，同上法收集菌體沉淀，－20 oC 凍存?zhèn)溆谩?/p>

4. 將誘導(dǎo)前后菌體沉淀用 20 ~ 40 μl PBS（pH= 8.0）重懸，加入等體積的 2×SDS上樣緩沖液，煮沸加熱 5 min，SDS 聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離 ，考馬斯亮藍(lán)染色 3 小時(shí)后，脫色觀察結(jié)果。

5. 選取誘導(dǎo)成功的細(xì)菌克隆，擴(kuò)大誘導(dǎo)規(guī)模，收集菌體沉淀，于－20 oC 保 存 ，準(zhǔn)備做下一步分析及純化。

二、重組蛋白質(zhì)的分離純化

重組蛋白質(zhì)的可溶性鑒定

1.將按上法誘導(dǎo)培養(yǎng)后收集的菌體重懸于裂解液 1 (Lysis buffer under nativeconditions )中，然后在－80 oC 低溫冰箱中放置 10 min。

2. 冰中解凍。

3. 在冰浴上用超聲破碎儀破菌 6 次，每次 10 sec，間歇 10 sec，電壓 200-300 V。

4. 10000g，4oC，離心 20 min，取上清（為溶液 A）， －20 oC 保存；另將沉淀用同樣裂解液 1 溶解（為溶液 B），同樣－20 oC 保存，供后繼分析使用。

5. 將上述 A、B 溶液和誘導(dǎo)前后的細(xì)菌進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，比較分析重組蛋白質(zhì)的溶解性。如果誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)位于 A 溶液中，則為可溶性蛋白；如果是在 B 溶液中，則為非可溶蛋白。

重組蛋白質(zhì)為非可溶性蛋白（變性條件下）的分離純化

1.將菌體沉淀溶于適量裂解液 2（Lysis buffer under denaturing conditions ）中，室溫下攪拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。

2. 10000g，4 oC，離心 30 min，收集上清液。

3. 將 Ni-NTA Agarose 充填柱子，并連接于 Pharmarcia 低壓液相層析系統(tǒng)，用 5倍柱體積的裂解液 2 平衡 Ni-NTA Agarose，調(diào)節(jié) A280 值至零線。

4.將適量上清液上樣到 Ni-NTA Agarose 柱子中，并用 lysis buffer 沖洗至 A280值低于 0.01。

5. 分別用 5～10 倍柱體積的清洗液 1 和清洗液 2（Wash buffer 1 and 2）清洗柱子，直至 A280 值低于 0.01。

6. 用洗脫液（Elution buffer）洗脫重組蛋白質(zhì)，在 A280 值監(jiān)測下，收集出現(xiàn)峰線后含有重組蛋白的所有洗脫液。

三、重組蛋白質(zhì)的復(fù)性、凍干和定量

純化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液緩慢透析，最終用 0.01×PBS 透析，透析后的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)凍干成粉狀。以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)，采用 BIO-RAD 公司蛋白質(zhì)定量試劑(protein assay)比色測定蛋白質(zhì)的含量。