酶切反應(yīng)條件的優(yōu)化

當(dāng)建立內(nèi)切酶酶切反應(yīng)體系時(shí)有幾個(gè)關(guān)鍵因素需要考慮。比如如何在正確的反應(yīng)體系中，加入適量的DNA、內(nèi)切酶和緩沖液，就可以獲得最佳酶切效果。根 據(jù)定義，在50μl體系中，1單位的限制性內(nèi)切酶可以在60分鐘內(nèi)*切割1μg的底物DNA。上述酶、DNA與總反應(yīng)體積的比值可以做為建立反應(yīng)體系的 參考數(shù)據(jù)。但是，目前大多數(shù)科研人員會(huì)遵循下表中所列的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件，使用5－10倍的過(guò)量酶切割DNA，這樣有利于克服由于DNA來(lái)源不同、質(zhì)量和純度 不同而造成的實(shí)驗(yàn)失敗。

“標(biāo)準(zhǔn)"反應(yīng)體系

內(nèi)切酶

從冰箱取出后請(qǐng)一直置于冰上。

酶最后加入到反應(yīng)體系中。

加入酶之前將反應(yīng)混合物混勻，可以用移液槍上下吹打或輕彈管壁，然后在離心機(jī)中快速離心。切忌振蕩混勻！

當(dāng)切割超螺旋質(zhì)粒和瓊脂糖包埋DNA時(shí)，通常需要超過(guò)1unit/μg的酶量以達(dá)到*酶切。

DNA

避免酚、氯仿、酒精、EDTA、變性劑或過(guò)多鹽離子的污染。

甲基化的DNA會(huì)抑制某些酶的切割效率。

緩沖液

使用終濃度為1X的緩沖液。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入終濃度為100μg/ml的BSA（1:100稀釋）。

在不需要BSA即可達(dá)到最佳活性的酶切反應(yīng)中如果加入BSA也不會(huì)影響酶切效果。

反應(yīng)總體積

建議在50μl反應(yīng)體系中消化1μg底物DNA。

為避免星號(hào)活性，甘油濃度應(yīng)<5%。

加入內(nèi)切酶（貯存于50%甘油中）的量應(yīng)不超過(guò)總體積的10%。

使用以下技術(shù)，內(nèi)切酶的反應(yīng)條件可能未達(dá)到最佳反應(yīng)條件：克隆、基因分型、突變檢測(cè)、基因定位、探針制備、測(cè)序和甲基化檢測(cè)等。

內(nèi)切酶貯存液中的添加物（如：甘油和鹽）和底物溶液中尚存的殘余物（如：鹽、EDTA或乙醇）會(huì)導(dǎo)致小體積反應(yīng)體系出現(xiàn)問(wèn)題。NEB提供了一系列高保真內(nèi)切酶（方便建立反應(yīng)體系。下述為小體積反應(yīng)體系反應(yīng)指南。

酶切反應(yīng)體系的選擇

反應(yīng)時(shí)間

標(biāo)準(zhǔn)一小時(shí)。

可加入過(guò)量的酶以縮短反應(yīng)時(shí)間，或者使用能夠快速酶切的內(nèi)切酶。

對(duì)于許多酶，都可以用更少單位的酶消化16小時(shí)。

終止反應(yīng)

若消化后的DNA不需要進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作：

用終止液終止反應(yīng)【50%甘油、50mMEDTA（pH8.0）和0.05%溴酚藍(lán)（NEB#B7021）】。按每50μl反應(yīng)體系中加入10μl的比例進(jìn)行。

若消化后的DNA需要進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作：

用熱失活法。

利用商業(yè)化的離心柱或酚/氯仿抽提去除內(nèi)切酶。

貯存

大多數(shù)內(nèi)切酶建議保存在-20℃。只有少數(shù)內(nèi)切酶若貯存時(shí)間超過(guò)30天建議保存在-70℃。詳細(xì)的貯存信息請(qǐng)參閱內(nèi)切酶使用說(shuō)明書或目錄。

10X反應(yīng)緩沖液和BSA貯存液也應(yīng)保存在-20℃。

不要將BSA直接加入到10X反應(yīng)緩沖液中再凍存，因?yàn)檫@樣BSA會(huì)產(chǎn)生沉淀。

穩(wěn)定性

在任何情況下，都應(yīng)盡可能的避免將酶置于高于-20℃的溫度下。

對(duì)照反應(yīng)

如果在切割底物DNA時(shí)遇到了問(wèn)題，建議加入以下對(duì)照實(shí)驗(yàn)：

沒(méi)有加入內(nèi)切酶的實(shí)驗(yàn)DNA，以檢測(cè)DNA制備和反應(yīng)緩沖液中是否存在污染。

加入了內(nèi)切酶的對(duì)照DNA（含有多個(gè)已知內(nèi)切酶切割位點(diǎn)的DNA，如LambdaDNA或腺病毒-2DNA），以檢測(cè)內(nèi)切酶的活性。

如果對(duì)照DNA能夠被切割而實(shí)驗(yàn)中的底物DNA不能，可以將這兩種DNA混合在一起再進(jìn)行酶切，以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)用的底物DNA中是否存在抑制反應(yīng)的物質(zhì)。如果確實(shí)存在某種抑制因子（通常為鹽、EDTA或酚），則混合之后對(duì)照DNA也不能被切割。

注意：由于某些酶與DNA結(jié)合的親和性非常高，所以不能很好地與產(chǎn)物分離。這樣在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)就會(huì)出現(xiàn)彌散現(xiàn)象。若出現(xiàn)這種情況，可以在反應(yīng)結(jié)束后加入終濃度為0.1-0.5%的SDS，帶型會(huì)更加清晰。