干貨分享！比一比，分選細(xì)胞您需要多長時間？

細(xì)胞分選在多種研究領(lǐng)域都有涉及，例如腫瘤學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)，免疫學(xué)等。上次和大家分享了磁珠分選，除了磁珠分選還有流式分選，今天小編在這里跟大家聊一下流式分選的原理、應(yīng)用及與磁珠分選的區(qū)別，希望能幫到大家一二。

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流式細(xì)胞儀分選原理

流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞有兩種方法：一是“Catch Tuber"即“捕獲管法"就是機(jī)械手臂以極快的速度出入樣品液流，在細(xì)胞通過激光照射并被確認(rèn)之后快速捕獲目標(biāo)細(xì)胞至收集系統(tǒng)中，此種方法常用于小型臺式機(jī)。另一種方法是電子偏轉(zhuǎn)的方式，即將熒光染色確認(rèn)的細(xì)胞標(biāo)記正或負(fù)電荷，通過電磁場偏轉(zhuǎn)而分離，此種方法常用于大型科研型機(jī)器。

電子偏轉(zhuǎn)示意圖

操作流程

（1）先制備單細(xì)胞懸液（可檢測多種樣本的單細(xì)胞懸液：外周血、骨髓、細(xì)胞穿刺液、洗脫液、實體組織、培養(yǎng)細(xì)胞等）

（2）樣本染色

①核酸標(biāo)記：通過核酸染料DAPI、PI等與核酸（DNA）結(jié)合，核酸含量越高，結(jié)合的染料越多，故可以通過核酸染料的多少以及強(qiáng)弱進(jìn)行細(xì)胞周期分選。

②蛋白標(biāo)記：偶聯(lián)熒光素的單克隆抗體與細(xì)胞表面/胞內(nèi)的抗原結(jié)合，結(jié)合的量越多，熒光信號就越強(qiáng)。

③熒光報告蛋白：很多報告蛋白是熒光蛋白（GFP、DsRed等），可成為流式檢測時熒光信號的來源。

（3）細(xì)胞分選

鞘液和樣品流進(jìn)入噴嘴后，在電磁傳感器產(chǎn)生的高頻振蕩下，形成穩(wěn)定的液滴，然后將熒光染色確認(rèn)的細(xì)胞標(biāo)記正或負(fù)電荷，通過電偏轉(zhuǎn)而分離。

（4）分選后細(xì)胞可進(jìn)一步做分子生物學(xué)研究，如熒光定量PCR、western blot、細(xì)胞培養(yǎng)等。

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影響流式分選的因素

分選中我們一般都關(guān)心分選速度、分選純度、分選得率、分選活性。

（1）如何提高分選速度：

振蕩頻率、鞘液壓力、噴嘴大小、上樣速度

-振蕩頻率越高，分選速度越快；

-振蕩頻率越高，鞘液壓力也隨之增加；

-若要形成穩(wěn)定液滴，最佳振蕩頻率：f=V/（4.5d）；

-鞘液壓力和噴嘴大小一定時，振蕩頻率相對固定。

-上樣速度過快，得率會降低，故最佳上樣速度=1/4*f

（2）如何提高分選純度：

-精確設(shè)定液滴延遲時間（Drop Delay）：指細(xì)胞通過激光檢測區(qū)到液滴分離斷電位置的間隔時間。

-保證液流穩(wěn)定：鞘液和樣品流進(jìn)入噴嘴后，在電磁傳感器產(chǎn)生的高頻振蕩下，形成穩(wěn)定的液滴，即液流的斷點位置維持在一個固定的位置。

-選擇合適的分選模式

-排除樣本粘連

-合理設(shè)門（用散點圖）

-合理閾值設(shè)定

（3）如何提高分選得率：

- Drop Delay液滴延遲時間要準(zhǔn)確，液流穩(wěn)定

-如果不考慮純度的情況下（不需后續(xù)培養(yǎng)），可以選擇Enrich/yield分選模式

（4）如何提高分選活性

-與細(xì)胞本身的活性有關(guān)

-與儀器潔凈程度有關(guān)

-與鞘液壓力、噴嘴大小有關(guān)（對于脆弱細(xì)胞，盡量采用低壓和大噴嘴，包裹細(xì)胞的液滴越大，對細(xì)胞的沖擊越小）

-與上樣管路設(shè)計及管壁光滑程度有關(guān)

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流式分選和磁珠分選的比較

總結(jié)：二者各有優(yōu)勢，不能相互取代。

磁珠分選的優(yōu)勢：

-操作簡單、分選速度快、細(xì)胞活性好。

流式分選優(yōu)勢：

-多參數(shù)分選，不同熒光強(qiáng)度的分選。

二者相互結(jié)合，可用于分選比例較低的細(xì)胞群。例如要分選人的造血干細(xì)胞CD43+CD38-,可以先用磁珠分選富集CD34+細(xì)胞，再結(jié)合流式分選出CD34+CD38-造血干細(xì)胞。

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流式分選的應(yīng)用

（1）流式分選在干細(xì)胞研究中的應(yīng)用

2013年6月，上海中科院生化所李勁松組、神經(jīng)所孫強(qiáng)組與健康所金穎組合作，建立來自食蟹猴孤雌囊胚的單倍體胚胎干細(xì)胞系，發(fā)表在Nature子刊Cell Research上，文中單倍體分選涉及到流式分選。

（2）流式分析在染色體分析分選中的應(yīng)用

瑞士的一組研究人員建立起一套符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的大規(guī)模體外擴(kuò)增異體反應(yīng)性NK細(xì)胞用于AML治療的實驗流程，采用經(jīng)GMP認(rèn)證的BD Influx分選出單一KIR（killer lmmunoglobulin-like Receptor）特異性的NK細(xì)胞，

（3）流式分析在熒光蛋白分選中的應(yīng)用

將CFP基因插入到Abcg2基因得到基因改造小鼠，流式分選Abcg2/GFP+骨髓細(xì)胞，并移植入小鼠體內(nèi)檢測造血能力，發(fā)現(xiàn)：Lin-GFP+細(xì)胞顯著富集造血干細(xì)胞，Lin-GFP-細(xì)胞無造血能力。

好了，今天小編給大家詳細(xì)的介紹了流式分選的原理、應(yīng)用及與磁珠分選的區(qū)別，希望對大家以后的實驗有用。