有助于提高蛋白表達(dá)目的的實(shí)驗(yàn)方案

　　克隆基因在細(xì)胞中表達(dá)對(duì)理論研究和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用都具有重要的意義。通過(guò)表達(dá)能探索和研究基因的功能以及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，同時(shí)克隆基因表達(dá)出所編碼的蛋白質(zhì)可供作結(jié)構(gòu)與功能的研究。大腸桿菌是目前應(yīng)用廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過(guò)細(xì)菌總蛋白量的80%。本實(shí)驗(yàn)中，攜帶有目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿菌BlL21中，在37℃，IPTG誘導(dǎo)下，超量表達(dá)攜帶有6個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的重組氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白，該蛋白可用一種通過(guò)共價(jià)偶連的次氨基三乙酸（NTA）使鎳離子（Ni2+）固相化的層析介質(zhì)加以提純，實(shí)為金屬熬合親和層析（MCAC）。蛋白質(zhì)的純化程度可通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。

　　有助于提高蛋白表達(dá)目的的實(shí)驗(yàn)方案：

　　1.降低蛋白合成的速度。可以通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)：

　　a.降低培養(yǎng)溫度b.使用弱啟動(dòng)子。

　　c.使用低拷貝數(shù)的質(zhì)粒表達(dá)載體d.降低誘導(dǎo)物的濃度。

　　e.在比較高的菌密度進(jìn)行較短的時(shí)間誘導(dǎo)。

　　2.改變培養(yǎng)基。

　　a.培養(yǎng)基中加入可以幫助蛋白折疊的因子。

　　b.加入緩沖液保持pH穩(wěn)定c.加入1%的葡萄糖，抑制lac啟動(dòng)子。

　　d.加入山梨糖醇等可以穩(wěn)定蛋白天然結(jié)構(gòu)的因子。

　　e.加入乙醇，thiols and disulfides等。

　　3.分泌表達(dá)。使目的蛋白分泌到周質(zhì)空間。

　　周質(zhì)空間的氧化性的環(huán)境有利于二硫鍵的形成，而胞內(nèi)則是還原性的。周質(zhì)空間有折疊酶DsbA和DsbC的存在，幫助蛋白正確折疊。

　　周質(zhì)空間很少有蛋白酶存在，不會(huì)被水解。

　　可以使對(duì)細(xì)胞有毒性的蛋白大量存在。