單抗制備的生產及純化方法

　　抗體是機體在抗原刺激下產生的能與該抗原特異性結合的免疫球蛋白。常規的抗體制備是通過動物免疫并采集抗血清的方法產生的，因而抗血清通常含有針對其他無關抗原的抗體和血清中其他蛋白質成分。一般的抗原分子大多含有多個不同的抗原決定簇，所以常規抗體也是針對多個不同抗原決定簇抗體的混合物。即使是針對同一抗原決定簇的常規血清抗體，仍是由不同B細胞克隆產生的異質的抗體組成。
 

　　單抗制備的生產及純化方法：
 

　　(1)動物體內生產單抗
 

　　①成年BALB/c小鼠腹腔接種降植烷或液體石蠟，每只小鼠0.3-0.5ml。
 

　　②7-10天后腹腔接種用PBS或無血清培養基稀釋的雜交瘤細胞，每只小鼠5×105/0.2ml。
 

　　③間隔5天后，每天觀察小鼠腹水產生情況，如腹部明顯膨大，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可采集腹水。通常每只小鼠可采3ml腹水。
 

　　④將腹水離心(2000r/min5分鐘)，除去細胞成分和其他的沉淀物，收集上清，測定抗體效價，分裝，70℃凍存備用。
 

　　(2)單克隆抗體的純化(辛酸-硫酸銨沉淀法)
 

　　①腹水4℃12000rpm離心15min，去除雜質。
 

　　②取1份腹水加2份0.06mol/LPH5.0醋酸緩沖液，按每毫升稀釋腹水加33ul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，室溫混合30min。
 

　　③4℃靜置2小時，取出12000g離心30分鐘，棄沉淀。
 

　　④上清經尼龍篩過濾，于50倍體積的0.01MPH7.4PBS中4℃透析6h。
 

　　⑤在透析后的上清中加入等體積飽和硫酸銨溶液。
 

　　⑥4℃靜置1h以上，10000g離心30分鐘，棄上清。
 

　　⑦沉淀溶于適量PBS(含137mmol/LNaCl，2.6mol/LKCl，0.2mmol/L EDTA)中，于50-100倍體積的PBS中透析過夜。
 

　　⑧取少量透析后樣品適當稀釋后，以紫外分光光度計檢測蛋白含量，SDS-PAGE，抗體純度。