scFV/Fab構(gòu)建

技術(shù)背景：

單鏈抗體（single-chian variable fragment，scFv），是由抗體重鏈的可變區(qū)與輕鏈的可變區(qū)在一段肽鏈連接下構(gòu)成的小分子，是具有抗體活性的小結(jié)構(gòu)功能結(jié)構(gòu)單位；單鏈抗體可以由表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，也可以用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行制備，由于其分子量小，穿透力強(qiáng)，半衰期短，免于抗原性低等等特點(diǎn)，所以在臨床診斷，治療，預(yù)防方面有重要作用和廣闊的應(yīng)用前景，本文就單鏈抗體結(jié)構(gòu)，制備，應(yīng)用等方面做一個(gè)概述。

scFv結(jié)構(gòu)，完整的抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈構(gòu)成，透過人工改造，可使其直接表達(dá)可變區(qū)，通過人工合成的鏈接肽基因?qū)⒖贵w重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接成重組基因，由該重組基因表達(dá)的抗體就稱之為單戀抗體，結(jié)構(gòu)上，可將重鏈的N端與輕鏈的C端相連，也可以將輕鏈的N端與重鏈的C端相連，鏈接肽長度通常為15-25個(gè)氨基酸，通常由甘氨酸和絲氨酸構(gòu)成，具有一定的彈性以及蛋白酶抗性，作用是鏈接重鏈輕鏈，并且保持一定的彈性，使重鏈輕鏈結(jié)合后仍然可以配對(duì)，構(gòu)成單價(jià)抗原結(jié)合位點(diǎn)。

Fab片段（Fragment of antigen binding）也叫做抗原結(jié)合片段，是抗體結(jié)構(gòu)筑龍可以與抗原結(jié)合的區(qū)域，由一條完整的輕鏈與重鏈的VH與CH1結(jié)構(gòu)域組成，分子量約為5X104   輕鏈與重鏈均存在一個(gè)恒定區(qū)與可變區(qū)，輕重鏈之間存在二硫鍵鏈接。目前Fab抗體可以在實(shí)驗(yàn)室中制備出來。

技術(shù)簡介：

單鏈抗體的制備：

scFv可在多個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，目前比較常用的，是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。

另外可以使用噬菌體展示技術(shù)生產(chǎn)得到scFv片段，通過免疫動(dòng)物得到雜交瘤細(xì)胞，從中提取cDNA，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR得到全套抗體的重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL，利用重疊PCR將VH和VL片段擴(kuò)增得到可變區(qū)基因片段，然后將基因克隆到噬菌體載體中了，電轉(zhuǎn)感受態(tài)大腸桿菌，輔助噬菌體超染，得到的上清液即為單鏈抗體庫，以抗原為固相，經(jīng)過3-5輪吸附-洗脫-擴(kuò)增篩選，即可得到單鏈抗體。

Fab片段的制備：

目前有酶解法、利用表達(dá)系統(tǒng)制備以及利用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行抗體庫篩選等方法進(jìn)行Fab片段的制備。

酶解法：通常用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等對(duì)免疫球蛋白G進(jìn)行降解，得到Fab，F(xiàn)c片段等產(chǎn)物；

利用表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)Fab片段：通常利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)；大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)速度快等優(yōu)點(diǎn)，但是容易形成包涵體，復(fù)性后活性難以保證活性；用哺乳動(dòng)物表達(dá)，可以順利形成二硫鍵；更接近天然Fab結(jié)構(gòu)，活性也更好；

噬菌體展示技術(shù)：制備Fab片段抗體庫，可經(jīng)過熟輪的篩選富集，即可得到高親和性的抗體。

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