基因甲基化研究

DNA甲基化主要形成5 -甲基胞嘧啶(5-mC) 和少量的N6-甲基腺嘌呤(N6-mA) 及7 -甲基鳥嘌呤
(7-mG)。DNA的甲基化可引起基因的失活，可引|起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白
質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。根據(jù)研究水平,甲基化的檢測分為三種:基因組甲基化水平
(MethylationContent)的分析,候選基因甲基化的分析以及基因組層次的DNA甲基化模式
(Methylationpattern)與甲基化譜(Methylation Profiling)的分析。

基組甲基化水平的分析主要采用HPLC或高效毛細(xì)管電泳法(HPCE) ;候選基因甲基化分析采用甲
基化敏感性限制性內(nèi)切酶PCR/Southern法、重亞硫酸鹽測序法、甲基化特異性的PCR等方法;銦組范
圍的DNA甲基化模式(Methylationpatterm)與甲基化譜(MethylationProfiling)分析方法主要有:限制性標(biāo)記基
因組掃描、甲基化間區(qū)位點(diǎn)擴(kuò)增等。
甲基化特異性的PCR (Methylation-specific PCR, MSP) :用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,所有未
發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變;隨后設(shè)計(jì)針對甲基化和非甲基化序列的引
物進(jìn)行PCR。如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引|物能得到擴(kuò)增片段，則說明該位點(diǎn)存在甲基化。             亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR, BSP) :該訪法首先用重亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生
甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴(kuò)增所需股，則尿嘧啶全部
轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，最后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序并且與未經(jīng)處理的序列比較，判斷是否CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基
化。此方法是精確度很高,能明確目的片段中每一個CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài), 但需要大量的克隆測序,過
程較為繁瑣、昂貴。流程如下:
1.基因組DNAA超聲打斷至100-500bp的片段
2. DNA的片段末端修復(fù)、3'端加A堿基,連接測序接頭
3.采用EZ DNA Methylattion-Gold kit進(jìn)行Bisulite處理
4.脫鹽處理，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行文庫片段大小選擇
5.合格的文庫用于上機(jī)測序。
高分辨率熔解曲線法(High Resolution Melting, HRM) :在非CpG島位置設(shè)計(jì)-對針對亞硫酸氫鹽
修飾后的DNA雙鏈的引物，這對引|物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發(fā)生了甲基化,亞
硫酸氫鹽處理后，末甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變,樣品中的
GC含發(fā)生改變，從而導(dǎo)致熔解溫度的變化。