慢病毒載體構(gòu)建與包裝

慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)目的序列的效果。對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因或目的shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，能夠比較方便快捷地實現(xiàn)目的基因或目的shRNA的長期、穩(wěn)定表達(dá)。

原理：慢病毒載體系統(tǒng)由兩部分組成，即包裝成分和載體成分。

包裝成分：由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白。包裝成分通常被分開構(gòu)建到兩個質(zhì)粒上，一個質(zhì)粒表達(dá)Gag和Pol蛋白，另一個質(zhì)粒表達(dá)Env蛋白，其目的也是降低恢復(fù)成野生型病毒的可能。將包裝成分與載體成分的3個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，即可在細(xì)胞上清中收獲只有一次性感染能力而無復(fù)制能力的、攜帶目的基因的HIV-1載體顆粒。

載體成分：與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。

實驗流程：

1.        慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建

2.        慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建

3.        慢病毒載體的包裝與濃縮純化