重組質粒構建與基因打靶

1.            質粒構建

流程：

1. 目的基因的PCR擴增

2. PCR產物純化

3. 載體和PCR產物進行雙酶切

4. 膠回收

5. 載體與目的基因的連接

6. 轉化

7. 菌落PCR鑒定

8. 重組質粒的抽提

2.            基因打靶（gene targeting）

基因打靶技術是一種定向改變生物活體遺傳信息的實驗手段。它的產生和發展建立在胚胎干(ES) 細胞技術和同源重組技術成就的基礎之上，通過對生物活體遺傳信息的定向修飾包括基因滅活、點突變引人、缺失突變、外源基因定位引入、染色體組大片段刪除等，并使修飾后的遺傳信息在生物活體內遺傳，表達突變的性狀，從而可以研究基因功能等生命科學的重大問題，以及提供相關的疾病治療、新藥篩選評價模型等。外源DNA與受體細胞染色體DNA上的同源序列之間發生重組，整合在預定位點，改變細胞遺傳特性的方法。建立在胚胎干細胞與同源重組的基礎之上。是一種定向改變生物遺傳信息的實驗手段。

實驗原理：首先獲得ES（胚胎干細胞） 細胞系，利用同源重組技術獲得帶有研究者預先設計突變的中靶ES 細胞。通過顯微注射或者胚胎融合的方法將經過遺傳修飾的ES 細胞引入受體胚胎內。經過遺傳修飾的ES 細胞仍然保持分化的全能性，可以發育為嵌合體動物的生殖細胞，使得經過修飾的遺傳信息經生殖系遺傳。獲得的帶有特定修飾的突變動物提供研究者一個特殊的研究體系，使他們可以在生物活體中研究特定基因的功能。

基因打靶的方式：全基因打靶、條件性打靶、誘導性打靶、組織特異性打靶和基因捕獲打靶等。

主要步驟：

1. 打靶載體的構建

2. 導入：顯微注射法（常用），電穿孔法，逆轉錄病毒載體法等；受體細胞一般采用胚胎干細胞（ES）

3. 篩選: (G418和GANC培養基)

a) 正負選擇系統（G418R/GANCR）

b) 正向選擇法

4. PCR進一步鑒定

5. 打靶ES細胞導入囊胚

6. 囊胚植入假孕母鼠子宮發育